优于国外同类材料丨SIS材料中纤维连接蛋白含量定量检测研究

作者：本站编辑    发布日期：2022-07-12

博辉瑞进具有自主知识产权的SIS生物材料，主要成分包含 I、III 型胶原、多种生长因子(TGF-β、VEGF和FGF等)和纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）等。

纤维连接蛋白（FN）是一种以二硫键连接的二聚体（220Ku）形式存在的糖蛋白，可由成纤维细胞、肌细胞和内皮细胞等多种细胞分泌。FN与多种细胞，包括成纤维细胞和内皮细胞等表现出黏附和迁移特性，具有“细胞外黏合剂”的美称。

FN在胚胎生成、伤口愈合和止血等过程中发挥着关键性的作用，脱细胞基质中FN的含量直接影响SIS的生物活性，本文选取了博辉瑞进的VIDASIS和美国COOK的Biodesign ，重点对两种SIS材料中FN的含量进行定量检测研究。该文章已于2018年2月发表于《生物学杂志》期刊，以下为部分摘录内容。说明：本文中提到的检测方法已申请专利保护，专利号ZL201710214434.5。

图为：2018年2月《生物学杂志》期刊封面

SIS降解方法研究

FN 与胶原具有较高的结合特性，在细胞外基质中以与胶原结合的状态存在，传统方法难以有效检测出脱细胞基质中的FN。为能使FN从结合状态转变为游离状态并进一步被酶解，实验首先研究了 FN 的释放方法。图1是不同酶解方式降解过程中SIS残留量的动态变化曲线。采用静态酶解法加入胶原酶后溶液中SIS残留量逐渐降低，酶解24 h后降解率仅为 60%，降解3d后仍有10%的SIS未被降解，4d后残留量趋于稳定，溶液中残留不能被降解的絮状物(图1) 。氨基酸分析结果表明，残留物中几乎不含有羟脯氨酸，表明SIS中的胶原成分被有效降解。但是采用该方法降解 SIS 的过程耗时长，且存在易染菌、酶失活以及随机降解率高等问题。为了提高酶解效率，实验尝试了分批次降解的方式，即降解一定时间后进行固液分离，沉淀物重新酶解。SIS 残留量在前3次降解过程中变化较明显，第1次换液时残留量为70% ，第2次换液时残留量为50% ，第3次换液时残留量约为30% (图1) ，该过程重复5次后SIS酶解较为完全。为了最大程度减少样品中蛋白损失，实验在分批次降解过程中降解次数增加至 6 次。

图1：静态酶解和分批次酶解过程中SIS残留量的动态变化

基于质谱的检测方法-FN特征多肽筛选

FN 经序列纯胰蛋白酶处理后产生大量低分子量多肽，实验对多肽进行了BLAST序列比对，只在猪源 FN 数据库被检出的肽段为猪源FN的特征多肽; 酶解后的多肽质谱信息用 SEQUEST 软件进行数据库搜索，多肽过滤参数为Xcorr＞1. 5 (单电荷)，Xcorr＞2. 0 (单 电荷) ，同时Deltacn＞0. 1，则所产生的肽段被认为是阳性结果。在 HPLC-MS 分析的质谱图中提取特征多肽的离子流图，低浓度样品可提取到且丰度较高，同时信噪比S /N＞ 10，即适合作为特征多肽。

将胰蛋白酶酶解后的猪源FN用离子阱质谱( LCQ)进行全扫描分析，得到猪源FN酶解多肽的总离子流图(图2) 。采用BLAST多序列比对发现猪源FN存在一定数量的特征多肽，再用Bioworks软件搜索猪源FN降解后的多肽质谱信息，筛选具有阳性结果的多肽段，根 据BLAST多序列比对和Bioworks软件搜库结果选定多肽SSPVVIDASTAIDAPSNLＲ为猪源FN的特征多肽，其丰度和二级碎片匹配度均较高。图3和图4分别为该多肽的提取离子流图(含一级质谱图)和二级质谱图，二级碎片离子与理论值匹配度较高。因此，可选择该多肽作为特征多肽，用于猪源FN类型识别及定量检测。

图2：猪源FN酶解产物总离子流图

图3：特征多肽的提取离子流图和一级质谱图

图4：特征多肽的二级质谱图

取不同浓度经变性酶解处理的猪源FN标准品溶液，从低浓度到高浓度依次进样50μL，按HPLC-MS定量检测条件分析，监测目标离子m/z = 957. 5，获得不同浓度猪源FN特征多肽的提取离子流图(图5) ，按照所选特征多肽提取离子流图峰面积为纵坐标、猪源 FN 标准品浓度为横坐标进行线性回归(图6) ，回归方程为y = 4109. 5 x－12. 82(Ｒ2 = 0. 995) ，在0. 0024～0. 048g /L浓度范围内二者线性关系良好。

图5：不同浓度的猪源FN特征多肽的提取离子流图

图6猪源FN标准品浓度与信号强度关系曲线

SIS中FN含量检测结果

称取50mg SIS( VIDASIS ) 加入胶原酶分5次酶解，合并5次酶解的上清液，冷冻干燥，得到123 mg冻干物(含提取液里的盐类物质)，取4 mg冻干后的产物复溶，利用胰蛋白酶酶解，酶解产物按照HPLC-MS定量检测方法进行分析，根据FN特征多肽的提取离子流色谱峰面积计算，样品溶液中FN的浓度为0. 007 mg /mL，则SIS( VIDASIS )中FN的含量为0. 43%。采用相同的测定方法，SIS ( Biodesign) 中 FN 的含量测定结果为 0. 17% 。

精密度与稳定性验证

将同一样品稀释成不同的浓度，分别为 2. 4、4. 8、9. 6、19. 2、48、96和192μg /mL，通过HPLC-MS检测其纤维连接蛋白含量，根据浓度梯度和峰面积关系，确定峰面积呈线性的浓度范围(图7) 。实验结果表明本方法的线性程度较高。

图7：FN质谱检测方法的线性范围

精密度

精确量取FN标准品100μL，按定量HPLC-MS条件进行分析，重复进样3次，结果(如图8) 显示，FN 标准品中特征多肽的峰面积相对偏差ＲSD为1. 31%，表明本方法精密度良好。

图8：FN质谱检测方法的精密度分析

稳定性

将样品分别于-20℃保存，于10、20和30 d时间用FULL SCAN测定3次样品，其峰面积分别为3. 82 x108、3. 45x108和3. 16x108，保存30d的样品峰面积略微减小，表明该方法具有较高的稳定性。

结论

FN作为细胞外基质重要组成部分，具有诸多生物学活性功能。采用分批次酶解和液质联用技术对SIS脱细胞基质材料中FN含量进行了定量检测。针对SIS的胶原酶酶解方案进行优化，消除了时间长，效率低等弊端，将胶原酶酶解时间由96 h降为 6 h，大大提高了酶解效率。实验中FN经Trypsin特异性酶解所得的特征多肽为SSPVVIDASTAIDAPSNLＲ，采用HPLC-MS对FN中这一特征多肽定量检测，准确地得到SIS中FN的含量。这种方法操作简便，且适用于组织中 FN 的检测。结果表明VIDASIS和Biodesign两种脱细胞材料中FN的含量分别为0. 43% 和0. 17%。博辉瑞进SIS生物材料纤维连接蛋白含量，优于COOK Biodesign SIS材料。

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