富含生物活性因子丨SIS材料中生长因子的定量检测研究


作者:本站编辑    发布日期:2022-06-16

 

博辉瑞进具有自主知识产权的SIS生物材料,主要成分包含 I、III 型胶原、纤维连接蛋白和多种生长因子(TGF-β、VEGF和FGF等)。生长因子是由多种细胞分泌,作用于特定的靶细胞,调节细胞分裂、基质合成与组织分化的细胞因子,有助于细胞功能的增强和血管化的形成。

本文重点对SIS材料中三种生长因子(TGF-β、VEGF和FGF)进行定量检测,并通过两种实验方法得出检测结果。该文章已于2018年5月发表于《材料科学》期刊,以下为部分摘录内容。

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图为:20185月《材料科学》期刊封面


生长因子介绍


TGF-β是一种丰富的骨基质蛋白,也是一种肽类抗炎症生长因子,广泛存在于正常组织及转化细胞中,在血小板和骨组织中含量较高,在骨形成和骨重建过程中发挥着极其重要的作用,可以通过控制免疫细胞(T细胞、B细胞等)的增殖、分化和活化来进行免疫调节,促进伤口愈合以及血管生长。

VEGF,是对血管内皮细胞具有高度特异性的血管源性生长因子,由血小板、血管平滑肌细胞、内皮细胞、成骨细胞或肿瘤细胞等合成和分泌,对于新血管形成至关重要,具有增加血管通透性和促进内皮细胞增殖等功能还具有保护神经的作用。

FGF是一组具有相似结构特征的多肽,广泛存在于机体组织内,具有很强的促细胞分裂和增殖活性的作用可诱导毛细血管的生成。

SIS材料成分.png 

图为:动画示意,SIS材料中富含I、III 型胶原、纤维连接蛋白和多种生长因子(TGF-β、VEGF和FGF等)

 

提取方法介绍

方法一:称取SIS材料粉碎后样品5mg,加入1mL Buffer 1,高速低温匀浆20~30 min 至液体呈胶体状,14000 rpm 高速离心30 min,提取上清液,定容到1mL,4℃保存。

方法二:称取SIS材料粉碎后样品5 mg,加入1mL Buffer1,高速低温匀浆20~30 min至液体呈胶体状,于4℃匀速搅拌24 h,14000 rpm 高速离心30 min,提取上清液,定容到1 mL,4℃保存。


ELISA 检测法

TGFβ1和VEGF采用双抗夹心ELISA法,FGF2采用竞争抑制ELISA法。

将两种方法处理的样品按ELISA试剂盒说明书操作,操作步骤如下(以TGFβ1为例):

1) 加样:分别设置标准孔、待测样品孔、空白孔,依次加入100μL不同浓度的标准品和样品,空白孔加标准品缓冲液,酶标板覆膜后37℃温育1 h,弃去液体后甩干;

2) 每孔加检测溶液A工作液100μL,37℃温育1 h,弃去液体,每孔用350μL洗涤液洗涤1~2 min并甩干,该过程重复3次;

3) 每孔加检测溶液B工作液100μL,37℃温育1 h,弃去液体,每孔用350μL洗涤液洗涤1~2 min并甩干,该过程重复5次;

4) 每孔加90μL TMB底物溶液,37℃避光显色(10~20 min),每孔加50μL终止溶液终止反应,轻轻摇匀;

5) 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(O.D.值);

6) 根据标准品建立标准曲线,代入公式得到样品中活性生长因子含量,再换算成其在 SIS 补片样品干重中的含量。


检测结果

TGFβ1检测结果

根据ELISA试剂盒不同浓度的TGFβ1标准品在450nm波长下的光密度值(O.D.值)做成标准曲线,如图1所示。

图1-标准曲线.png 

1不同浓度 TGFβ1 标准品的 O.D.值标准曲线

如图2所示,通过方法一检测SIS中TGFβ1的含量为5391±370 pg/g,方法二检测SIS中TGFβ1的含量为8375±2125 pg/g。

图2:TGFβ1.jpg 

2:两种处理方法的 TGFβ1 检测结果对比

VEGF检测结果

根据ELISA试剂盒不同浓度的VEGF标准品在450nm波长下的光密度值(O.D.值)做成标准曲线,如图3所示。

图3-标准曲线.png 

3:不同浓度 VEGF 标准品的 O.D.值标准曲线

 

如图4所示,通过方法一检测SIS中VEGF的含量为3974±871pg/g,方法二检测SIS中VEGF的含量为5486±1043 pg/g。

图4:VEGF.jpg 

4两种处理方法 VEGF 检测结果对比

FGF2 检测结果

根据 ELISA 试剂盒不同浓度的 FGF2 标准品在 450 nm 波长下的光密度值(O.D.值)做成标准曲线,如图 5 所示。

图5-标准曲线.png 

5:不同浓度 FGF2 标准品的 O.D.值标准曲线

如图6所示,通过方法一检测SIS中FGF2的含量为3990±1372 pg/g,方法二检测SIS中FGF2的含量为2668±384 pg/g。

图6:FGF2 .jpg 

6为两种处理方法 FGF2 检测结果对比

 

结论

生长因子对提取条件要求非常严格,不同的生长因子由于其种类和作用机制的不同,其适宜的提取方法也不尽相同。该实验通过对 SIS 材料生长因子的预处理方法的比较,得到三种生长因子(TGFβ1、VEGF、FGF2)最适宜的提取方法并检测其含量。其中博辉SIS中 TGFβ1的的含量为8375±2125 pg/g、VEGF的含量为5486±1043 pg/g、FGF2的含量为3990±1372pg/g

创面愈合是一个复杂的生物学过程,生长因子在改善各种生理和病理状态、促进组织再生、修复及创伤愈合过程等方面发挥着重要的作用,在促进肉芽组织形成的同时,加速创面再上皮化进程。

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图为:SIS材料博瑞金®口腔修复膜

 

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