富含生物活性因子丨SIS材料中生长因子的定量检测研究

作者：本站编辑    发布日期：2022-06-16

博辉瑞进具有自主知识产权的SIS生物材料，主要成分包含 I、III 型胶原、纤维连接蛋白和多种生长因子(TGF-β、VEGF和FGF等)。生长因子是由多种细胞分泌，作用于特定的靶细胞，调节细胞分裂、基质合成与组织分化的细胞因子，有助于细胞功能的增强和血管化的形成。

本文重点对SIS材料中三种生长因子(TGF-β、VEGF和FGF)进行定量检测，并通过两种实验方法得出检测结果。该文章已于2018年5月发表于《材料科学》期刊，以下为部分摘录内容。

图为：2018年5月《材料科学》期刊封面

生长因子介绍

TGF-β，是一种丰富的骨基质蛋白，也是一种肽类抗炎症生长因子，广泛存在于正常组织及转化细胞中，在血小板和骨组织中含量较高，在骨形成和骨重建过程中发挥着极其重要的作用，可以通过控制免疫细胞(T细胞、B细胞等)的增殖、分化和活化来进行免疫调节，促进伤口愈合以及血管生长。

VEGF，是对血管内皮细胞具有高度特异性的血管源性生长因子，由血小板、血管平滑肌细胞、内皮细胞、成骨细胞或肿瘤细胞等合成和分泌，对于新血管形成至关重要，具有增加血管通透性和促进内皮细胞增殖等功能，还具有保护神经的作用。

FGF，是一组具有相似结构特征的多肽，广泛存在于机体组织内，具有很强的促细胞分裂和增殖活性的作用，可诱导毛细血管的生成。

图为：动画示意，SIS材料中富含I、III 型胶原、纤维连接蛋白和多种生长因子(TGF-β、VEGF和FGF等)

提取方法介绍

方法一：称取SIS材料粉碎后样品5mg，加入1mL Buffer 1，高速低温匀浆20~30 min 至液体呈胶体状，14000 rpm 高速离心30 min，提取上清液，定容到1mL，4℃保存。

方法二：称取SIS材料粉碎后样品5 mg，加入1mL Buffer1，高速低温匀浆20~30 min至液体呈胶体状，于4℃匀速搅拌24 h，14000 rpm 高速离心30 min，提取上清液，定容到1 mL，4℃保存。

ELISA 检测法

TGFβ1和VEGF采用双抗夹心ELISA法，FGF2采用竞争抑制ELISA法。

将两种方法处理的样品按ELISA试剂盒说明书操作，操作步骤如下(以TGFβ1为例)：

1) 加样：分别设置标准孔、待测样品孔、空白孔，依次加入100μL不同浓度的标准品和样品，空白孔加标准品缓冲液，酶标板覆膜后37℃温育1 h，弃去液体后甩干；

2) 每孔加检测溶液A工作液100μL，37℃温育1 h，弃去液体，每孔用350μL洗涤液洗涤1~2 min并甩干，该过程重复3次；

3) 每孔加检测溶液B工作液100μL，37℃温育1 h，弃去液体，每孔用350μL洗涤液洗涤1~2 min并甩干，该过程重复5次；

4) 每孔加90μL TMB底物溶液，37℃避光显色(10~20 min)，每孔加50μL终止溶液终止反应，轻轻摇匀；

5) 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(O.D.值)；

6) 根据标准品建立标准曲线，代入公式得到样品中活性生长因子含量，再换算成其在 SIS 补片样品干重中的含量。

检测结果

TGFβ1检测结果

根据ELISA试剂盒不同浓度的TGFβ1标准品在450nm波长下的光密度值(O.D.值)做成标准曲线，如图1所示。

图1为：不同浓度 TGFβ1 标准品的 O.D.值标准曲线

如图2所示，通过方法一检测SIS中TGFβ1的含量为5391±370 pg/g，方法二检测SIS中TGFβ1的含量为8375±2125 pg/g。

图2:两种处理方法的 TGFβ1 检测结果对比

VEGF检测结果：

根据ELISA试剂盒不同浓度的VEGF标准品在450nm波长下的光密度值(O.D.值)做成标准曲线，如图3所示。

图3：不同浓度 VEGF 标准品的 O.D.值标准曲线

如图4所示，通过方法一检测SIS中VEGF的含量为3974±871pg/g，方法二检测SIS中VEGF的含量为5486±1043 pg/g。

图4为：两种处理方法 VEGF 检测结果对比

FGF2 检测结果

根据 ELISA 试剂盒不同浓度的 FGF2 标准品在 450 nm 波长下的光密度值(O.D.值)做成标准曲线，如图 5 所示。

图5为：不同浓度 FGF2 标准品的 O.D.值标准曲线

如图6所示，通过方法一检测SIS中FGF2的含量为3990±1372 pg/g，方法二检测SIS中FGF2的含量为2668±384 pg/g。

图6为：两种处理方法 FGF2 检测结果对比

结论

生长因子对提取条件要求非常严格，不同的生长因子由于其种类和作用机制的不同，其适宜的提取方法也不尽相同。该实验通过对 SIS 材料生长因子的预处理方法的比较，得到三种生长因子(TGFβ1、VEGF、FGF2)最适宜的提取方法并检测其含量。其中博辉SIS中 TGFβ1的的含量为8375±2125 pg/g、VEGF的含量为5486±1043 pg/g、FGF2的含量为3990±1372pg/g。

创面愈合是一个复杂的生物学过程，生长因子在改善各种生理和病理状态、促进组织再生、修复及创伤愈合过程等方面发挥着重要的作用，在促进肉芽组织形成的同时，加速创面再上皮化进程。

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