优于国外同类材料丨SIS材料中纤维连接蛋白含量定量检测研究


作者:本站编辑    发布日期:2022-07-12


博辉瑞进具有自主知识产权的SIS生物材料,主要成分包含 I、III 型胶原、多种生长因子(TGF-β、VEGF和FGF等)和纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)等。

纤维连接蛋白(FN)是一种以二硫键连接的二聚体(220Ku)形式存在的糖蛋白,可由成纤维细胞、肌细胞和内皮细胞等多种细胞分泌。FN与多种细胞,包括成纤维细胞和内皮细胞等表现出黏附和迁移特性,具有“细胞外黏合剂的美称。

FN在胚胎生成、伤口愈合和止血等过程中发挥着关键性的作用,脱细胞基质中FN的含量直接影响SIS的生物活性,本文选取了博辉瑞进的VIDASIS和美国COOKBiodesign 重点对两种SIS材料中FN的含量进行定量检测研究。该文章已于2018年2月发表于《生物学杂志》期刊,以下为部分摘录内容。说明:本文中提到的检测方法已申请专利保护,专利号ZL201710214434.5。

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图为:20182月《生物学杂志》期刊封面

SIS降解方法研究

FN 与胶原具有较高的结合特性,在细胞外基质中以与胶原结合的状态存在,传统方法难以有效检测出脱细胞基质中的FN。为能使FN从结合状态转变为游离状态并进一步被酶解,实验首先研究了 FN 的释放方法。图1是不同酶解方式降解过程中SIS残留量的动态变化曲线。采用静态酶解法加入胶原酶后溶液中SIS残留量逐渐降低,酶解24 h后降解率仅为 60%,降解3d后仍有10%的SIS未被降解,4d后残留量趋于稳定,溶液中残留不能被降解的絮状物(图1) 。氨基酸分析结果表明,残留物中几乎不含有羟脯氨酸,表明SIS中的胶原成分被有效降解。但是采用该方法降解 SIS 的过程耗时长,且存在易染菌、酶失活以及随机降解率高等问题。为了提高酶解效率,实验尝试了分批次降解的方式,即降解一定时间后进行固液分离,沉淀物重新酶解。SIS 残留量在前3次降解过程中变化较明显,第1次换液时残留量为70% ,第2次换液时残留量为50% ,第3次换液时残留量约为30% (图1) ,该过程重复5次后SIS酶解较为完全。为了最大程度减少样品中蛋白损失,实验在分批次降解过程中降解次数增加至 6 次。

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1:静态酶解和分批次酶解过程中SIS残留量的动态变化

 

基于质谱的检测方法-FN特征多肽筛选

FN 经序列纯胰蛋白酶处理后产生大量低分子量多肽,实验对多肽进行了BLAST序列比对,只在猪源 FN 数据库被检出的肽段为猪源FN的特征多肽; 酶解后的多肽质谱信息用 SEQUEST 软件进行数据库搜索,多肽过滤参数为Xcorr>1. 5 (单电荷),Xcorr>2. 0 (单 电荷) ,同时Deltacn>0. 1,则所产生的肽段被认为是阳性结果。在 HPLC-MS 分析的质谱图中提取特征多肽的离子流图,低浓度样品可提取到且丰度较高,同时信噪比S /N> 10,即适合作为特征多肽。

将胰蛋白酶酶解后的猪源FN用离子阱质谱( LCQ)进行全扫描分析,得到猪源FN酶解多肽的总离子流图(图2) 。采用BLAST多序列比对发现猪源FN存在一定数量的特征多肽,再用Bioworks软件搜索猪源FN降解后的多肽质谱信息,筛选具有阳性结果的多肽段,根 据BLAST多序列比对和Bioworks软件搜库结果选定多肽SSPVVIDASTAIDAPSNLR为猪源FN的特征多肽,其丰度和二级碎片匹配度均较高。图3和图4分别为该多肽的提取离子流图(含一级质谱图)和二级质谱图,二级碎片离子与理论值匹配度较高。因此,可选择该多肽作为特征多肽,用于猪源FN类型识别及定量检测。

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2:猪源FN酶解产物总离子流图

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3:特征多肽的提取离子流图和一级质谱图

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4:特征多肽的二级质谱图

取不同浓度经变性酶解处理的猪源FN标准品溶液,从低浓度到高浓度依次进样50μL,按HPLC-MS定量检测条件分析,监测目标离子m/z = 957. 5,获得不同浓度猪源FN特征多肽的提取离子流图(图5) ,按照所选特征多肽提取离子流图峰面积为纵坐标、猪源 FN 标准品浓度为横坐标进行线性回归(图6) ,回归方程为y = 4109. 5 x-12. 82(R2 = 0. 995) ,在0. 0024~0. 048g /L浓度范围内二者线性关系良好。

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5:不同浓度的猪源FN特征多肽的提取离子流图

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6猪源FN标准品浓度与信号强度关系曲线

SISFN含量检测结果

称取50mg SIS( VIDASIS ) 加入胶原酶分5次酶解,合并5次酶解的上清液,冷冻干燥,得到123 mg冻干物(含提取液里的盐类物质),取4 mg冻干后的产物复溶,利用胰蛋白酶酶解,酶解产物按照HPLC-MS定量检测方法进行分析,根据FN特征多肽的提取离子流色谱峰面积计算,样品溶液中FN的浓度为0. 007 mg /mL,则SIS( VIDASIS )中FN的含量为0. 43%。采用相同的测定方法,SIS ( Biodesign) 中 FN 的含量测定结果为 0. 17% 。

精密度与稳定性验证

将同一样品稀释成不同的浓度,分别为 2. 4、4. 8、9. 6、19. 2、48、96和192μg /mL,通过HPLC-MS检测其纤维连接蛋白含量,根据浓度梯度和峰面积关系,确定峰面积呈线性的浓度范围(图7) 。实验结果表明本方法的线性程度较高。

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7:FN质谱检测方法的线性范围

精密度

精确量取FN标准品100μL,按定量HPLC-MS条件进行分析,重复进样3次,结果(如图8) 显示,FN 标准品中特征多肽的峰面积相对偏差RSD为1. 31%,表明本方法精密度良好。

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8:FN质谱检测方法的精密度分析

稳定性

将样品分别于-20℃保存,于10、20和30 d时间用FULL SCAN测定3次样品,其峰面积分别为3. 82 x108、3. 45x108和3. 16x108,保存30d的样品峰面积略微减小,表明该方法具有较高的稳定性。

结论

FN作为细胞外基质重要组成部分,具有诸多生物学活性功能。采用分批次酶解和液质联用技术对SIS脱细胞基质材料中FN含量进行了定量检测。针对SIS的胶原酶酶解方案进行优化,消除了时间长,效率低等弊端,将胶原酶酶解时间由96 h降为 6 h,大大提高了酶解效率。实验中FN经Trypsin特异性酶解所得的特征多肽为SSPVVIDASTAIDAPSNLR,采用HPLC-MS对FN中这一特征多肽定量检测,准确地得到SIS中FN的含量。这种方法操作简便,且适用于组织中 FN 的检测。结果表明VIDASIS和Biodesign两种脱细胞材料中FN的含量分别为0. 43% 和0. 17%。博辉瑞进SIS生物材料纤维连接蛋白含量,优于COOK Biodesign SIS材料。

 

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